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NEWS血清脂蛋白电泳实验操作步骤 - 尊龙凯时生物医疗指南
来源:解雅义 日期:2025-03-21实验原理是利用脂类染料(如苏丹黑或油红O)对血清脂蛋白进行预染,然后将预染的血清放置于琼脂糖凝胶板上进行电泳分离。通电后,脂蛋白会向正极移动,形成几个不同的区带。
1. 尊龙凯时巴比缓冲液(pH 8.6,离子强度 0.075):该溶液由154 g巴比/妥钠、276 g巴比/妥和0.292 g EDTA酸加水溶解后定容至1000 ml。
2. 三羟甲基/氨基甲/烷缓冲液(pH 8.6):凝胶缓冲液由12.12 g三羟甲基/氨基甲/烷、0.29 g EDTA和15.85 g NaCl加水溶解后定容至1000 ml。
3. 琼脂糖凝胶:将0.45 g琼脂糖、50 ml三羟甲基/氨基甲/烷缓冲液和50 ml水混合,加热至溶解后立即停止加热。
4. 挖槽工具:制作切口刀,刀片长15 mm,中间夹有机玻璃或木片,用螺丝固定使两刀片相距15 mm;挖槽小匙用直径15 mm、约6 cm的铜丝,一端锤成扁平,用砂纸磨光。
5. 电泳槽及电泳仪:应与血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的设备相同。
1. 预染血清:将0.2 ml血清与0.2 ml苏丹黑染色液混合在小试管中,置于37℃水浴中染色30分钟后,离心(2000转/分,约5分钟)。
2. 制备琼脂糖凝胶板:将已配制的0.45%琼脂糖凝胶在沸水中加热融化,使用吸管将凝胶溶液注入载玻片,每片25 ml,静置约30分钟凝固(天气热时可延长时间,也可放入冰箱加速凝固)。
3. 点加血清:在已凝固的琼脂糖凝胶板一端约2 cm处,用切口刀垂直切入凝胶后立即取出,再用铜丝小匙提取长方小条的凝胶。用小片滤纸吸干小槽中的水分,利用血色素吸管吸取约15 μl经过预染的血清,注入凝胶板的小槽内。
4. 电泳:将加过血清的凝胶板平行放入电泳槽中,样品应在阴极一端。两块三层纱布浸入巴比/妥缓冲液后,轻轻紧密贴在凝胶板两端,纱布的另一端浸于电泳槽内的巴比/妥缓冲液中(注意:此电极缓冲液不能用三羟甲烷缓冲液替代)。接通电源,电压设为120~130V,每片电流为3~4mA。电泳约15至55分钟后,可观察到分离的色带。
1. 电泳样品应为新鲜空腹血清。
2. 每一块凝胶上可平行挖两条小槽,以便加两个样品。
3. 可使用形状与小槽相同的有机玻璃片,在琼脂糖固化之前固定在适当位置,待凝固后取出,有助于直接加样,无需挖槽。
4. 如需保存电泳样本,可将电泳后的凝胶板(连同玻片)浸泡在清水中脱盐2小时,然后置于烘箱中(约80℃)烘干。
1. 正常人血清脂蛋白可形成三条区带,从负极到正极依次为β-脂蛋白(最深)、前β-脂蛋白(最浅)和α-脂蛋白(略深于前β-脂蛋白),原点处不应有乳糜微粒。
2. 若前β-脂蛋白深于α-脂蛋白,血清甘油三酯显著升高且胆固醇正常或略高,则可判断为Ⅳ型高脂蛋白血症。
3. 若β-脂蛋白区带明显加深,同时结合血清总胆固醇显著升高,甘油三酯正常者为Ⅱa型;如血清总胆固醇增高、甘油三酯略高于正常的前β略溶者则为Ⅱb型。
4. 若β-和前β-两区带相连,称“宽β区带”,并且血清甘油三酯与胆固醇均增高,可定为Ⅲ型。
5. 若原点出现乳糜微粒,而β和前β均正常或降低,同时血清甘油三酯显著升高,则可定为Ⅰ型。
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