细胞冻存是一种在低温条件下保存细胞的方法，旨在长时间保持细胞的活性和功能。这种技术对于细胞系的长期保存、实验的重复性、基因库的建立以及细胞治疗的储备都具有重要的意义。通过冻存，可以减少细胞在传代过程中的遗传变异，避免因污染、环境变化或实验操作失误导致的细胞损失。最佳的冷冻保存时机是在细胞处于最佳生长状态时。

冷冻保护剂是细胞冻存中的关键成分，常用的冷冻保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油。这些保护剂主要通过降低溶液的冰点，减少冰晶的形成，从而保护细胞免受冰晶造成的机械损伤。DMSO是一种适用于大多数细胞类型的冷冻保护剂，而对于对DMSO敏感的细胞，可以使用甘油作为替代。与此同时，选择合适的冻存培养基对于确保细胞在冻存后能有效恢复活性至关重要。

第1阶段：冷冻保存实验步骤

1. 在冷冻管上标记日期、研究人员姓名、细胞编号、传代数和细胞类型，还可以添加任何其他有用信息，如基因改造记录。

2. 如果是贴壁细胞，先除去培养基，使用PBS清洗细胞，添加适量的胰蛋白酶覆盖细胞，并在37°C培养箱中孵育约2分钟（具体时间应根据细胞类型调整）。接着，添加等量的培养基终止消化，用移液管轻轻吹打细胞，将其转移到50mL的Falcon管中。

3. 对于悬浮细胞，直接将所需体积的细胞转移到50mL的Falcon管中。

4. 使用血细胞计数器计数细胞以评估其活力。冷冻保存时，细胞活力应至少为75%。

5. 室温下以300×g离心5分钟后，去除上清液。

6. 准备冻存培养基（如表1所示）。

使用前将冻存培养基混合均匀并加热至37°C。该培养基中含有必要的冷冻保护剂，例如DMSO，以防止细胞内外冰晶的形成，从而避免损害细胞膜及其组成。需要注意的是，并非所有细胞类型均适合使用DMSO，有些情况下，可以考虑使用甘油作为替代。

7. 去除上清液后，加入冻存培养基至所需细胞密度。对于哺乳动物细胞，这个浓度通常为1×10⁶/mL。如果细胞在冻存液中的时间超过10分钟，应及时转移。

8. 将1mL样品分装到冷冻管中，并盖紧盖子。

9. 将冷冻管转移至室温的冷冻盒中，然后放入-80°C的冰箱。确保冷冻盒外周添加异丙醇，以使温度以每分钟1°C的速度稳定下降。这一缓慢的冷冻过程有助于防止细胞内冰晶的形成。

10. 大约24小时后，从冷冻盒中取出冷冻管，并转移至液氮中进行长期储存。一般情况下，冷冻的细胞可在液氮中保存数年，而不应在-80°C下保存超过一周，以防损害细胞活力。

第2阶段：解冻冷冻细胞系实验步骤

1. 从液氮储存器中取出冷冻管，迅速放入37°C水浴中，解冻至约80%（请勿在室温下解冻，时间不应超过1分钟）。快速解冻以减少细胞损伤以及迅速稀释和去除DMSO的毒性。

2. 使用移液器将冷冻管中的细胞转移到含有约10mL预热培养基的15mL Falcon管中。

3. 以300×g离心5分钟后，去除上清液，用适量培养基重悬细胞沉淀。

4. 将细胞悬液转移到培养容器中，并放入37°C培养箱中进行培养。

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