第三章：实时荧光定量PCR的应用

一、相对定量测定

在不同样品中进行基因表达量的相对值测定时，内参基因的选择显得尤为重要。选择内参基因时，应遵循以下原则：

1. 始终选择表达充沛且均一的基因作为内参基因；
2. 不可盲目选择常用内参基因；
3. 常用的内参基因包括GAPDH、Actin和Tublin。

内参基因的选择直接影响实验结果的有效性。一旦加入内参基因，便可以进行结果计算。

二、绝对定量

绝对定量是根据标准品来测定样品中基因表达量的绝对值（拷贝数）。标准品可包括：

1. A/克隆质粒；
2. B/PCR产物；
3. C/cDNA（用于扩增效率测定等，但不适用于绝对定量）。

拷贝数的计算需要平均分子量（MW）作为依据，其中：

• 双链DNA（dsDNA） = 碱基数 × 660道尔顿/碱基；
• 单链DNA（ssDNA） = 碱基数 × 330道尔顿/碱基；
• 单链RNA（ssRNA） = 碱基数 × 340道尔顿/碱基。

拷贝数计算公式为：

(602 x 10²³ 拷贝数/摩尔) × (浓度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml

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